Terapia Epigenómica

 Alteraciones epigenéticas en leucemia linfoblástica aguda (LLA)

• Mecanismo Epigenómica tratado

En la LLA se han identificado:

La metilación del ADN

La hipermetilación del ADN en regiones promotoras es una de las alteraciones epigenéticas más frecuentes en LLA; así mismo se encontró hipermetilación en genes que codifican proteínas involucradas en la señalización del receptor de glutamato, señalización de proteínas G y señalización mediada por adenosín monofosfato cíclico (cAMP), se identificó alteraciones en la metilación de genes asociados al proceso leucémico, como las quimiocinas CXCL1, CXCL3, CXCL5 y CXCL6 y las citocinas LTA e IL-7 

Algunas de las vías de señalización mayormente representadas por genes con alteraciones en la metilación en LLA son p53, WNT, EPHR, MAPK, y PI3K-AKT

La modificación de histonas

Se han detectado alteraciones en proteínas remodeladoras de histonas, como la sobreexpresión de enzimas desacetilasas de histonas, así como alteraciones en enzimas acetiltransferasas y metiltransferasas. (La HMT más estudiada en la LLA es MLL)

En la LLA también se altera la expresión de miRNAs, lo cual produce desregulación en la expresión de sus genes blanco.

• ¿Cómo se lo hizo?

1.- Inhibidores de la DNA-metiltransferasa, 5-azacitidina y decitabina, en combinación con fármacos quimioterapéuticos convencionales

Además de los agentes desmetilantes, se han probado agentes inhibidores de histonas en pacientes con LLA, como el vorinostat y el panobinostat

2.- En un estudio de fase II se probó la administración de decitabina en combinación con vorinostat antes de la quimioterapia de reinducción en niños y adultos con LLA

• Resultados

1.- En estos estudios se verifica evidencia de actividad clínica sin toxicidad excesiva

2.- En el estudio de fase II, en 1/13 pacientes se registró muerte atribuida a toxicidad. En 5/8 pacientes que completaron el tratamiento, se realizó un trasplante alogénico de células hematopoyéticas; de estos, tres murieron por causas relacionadas con el trasplante y dos sobrevivieron sin evidencia de la enfermedad

Bibliografía

1.- Navarrete M y Pérez P. Alteraciones epigenéticas en leucemia linfoblástica aguda. Boletín Médico del Hospital de México  [Internet]. 2017 [citado 31 agosto del 2024]. Disponible en: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1665114616301538?via%3Dihub

Técnicas de Edición de Ácidos Nucleicos

 Enfermedad de Huntington

Tipo de Edición (in vivo o ex vivo, somática o germinal)

In vivo: no se extraen células del cuerpo antes de realizar la edición.

Edición somática: es la más relevante para la enfermedad de Huntington. En este caso, el objetivo son las neuronas y otras células del cerebro afectadas por la mutación en el gen HTT. (1,2).

Dirigido hacia:

El sistema se dirige específicamente al gen HTT, el cual codifica para la proteína huntingtina. La mutación que causa la enfermedad es una expansión anormal de repeticiones de tripletes CAG en el gen HTT (1).

La eliminación de HTT N-terminal que contiene el dominio polyQ, independientemente de su alelo, podría ser una posible estrategia terapéutica para tratar la EH

Para eliminar el dominio polyQ de mHTT usando CRISPR/Cas9, diseñamos 4 ARN guía (gRNA) para apuntar a las regiones de ADN que flanquean la repetición CAG en el exón 1 de HTT humana

La sobreexpresión de Hsp70 y Parkina podría ayudar a reducir el acumulamiento de huntingtina mutada (3).

Dirigido por: CRISPR-Cas9

Vectores recombinantes de virus adenoasociados

Transposón piggyBac (2).

Órgano a tratar:

En la enfermedad de Huntington, el órgano principal a tratar mediante CRISPR-Cas9 es el cerebro, dando lugar a la corrección o eliminación de la mutación en el gen HTT dentro de las neuronas del cuerpo estriado (2).

Vía de administración

En la tecnología CRISPR/Cas9 se utilizó la ortóloga Cas9 de Staphylococcus aureus, que al tener una secuencia más pequeña puede ser empaquetada junto a una secuencia de ARN guía único en un vector individual de virus adenoasociados. En este estudio, aplicaron el sistema de edición en un modelo de ratón R6/2 (el cual contiene el extremo 5’ del gen HTT humano con una expansión patológica de CAG) mediante la inyección de vectores virales en el cuerpo estriado del ratón, los cuales transdujeron exitosamente las neuronas de este tejido (2).

Resultados a corto plazo

Los resultados de inmunohistoquímica mostraron que la interrupción in vivo del alelo mutante disminuyó las inclusiones neurotóxicas de huntingtina mutante (1).

Resultados a mediano plazo 

Corrección de la mutación mejora los síntomas neurológicos observados en los modelos de ratón, como problemas de coordinación, movilidad y cognición

Resultados a largo plazo

La eficacia y seguridad a largo plazo de CRISPR en el cerebro aún están en evaluación. Los estudios han indicado que la edición genética podría tener efectos sostenibles si se administra correctamente y se dirige específicamente al tejido afectado (1).

Estos resultados demuestran el potencial del sistema CRISPR/Cas9 para tratar la EH

Bibliografía

1.-Abad-Sojos S, Torres O y León K. Aplicación de la técnica CRISPR / Cas9 en la reducción e inactivación permanente de la enfermedad de Huntington. Rev. Bionatura. 2018 [citado 24 agosto 2024]. Disponible en: https://pdfs.semanticscholar.org/4c3a/3ee3508c688d8002378d9ede078798e9caf4.pdf

2.- Gómez S. Aplicaciones del sistema CRISPR/Cas9 en las enfermedades de Alzheimer, Parkinson y Huntington. repositorio institucional. 2022 [citado 24 agosto 2024]. Disponible en: https://repositorioinstitucional.buap.mx/server/api/core/bitstreams/a25fd5f0-887b-4d74-94e9-9e3745c2e809/content

3.-Yang S, Chang R et al. La edición genética mediada por CRISPR/Cas9 mejora la neurotoxicidad en un modelo de ratón de la enfermedad de Huntington. The Journal of Clinical Investigation. 2017 [citado 24 agosto 2024]. Disponible en: https://www.jci.org/articles/view/92087

Terapia regenerativa o terapia celular

 Terapia celular en el infarto del miocardio

Tipo de Stem Cell

Células madre mesenquimales extracardiacas y estromacales

Método de obtención

Estas células pueden obtenerse de la médula ósea del propio paciente, con lo que se evitan futuros problemas de rechazo. A partir de ella se ha conseguido, en ratones, una línea celular cardiomiogénica (1).

Vía de administración

Se han inyectado, tanto directamente en el tejido muscular que rodea al área infartada, como por vía intracoronaria mediante cateterismo o por vía transendocárdica (1-2).

Por vía intracoronaria las células madre se inyectan directamente en las arterias coronarias mediante un catéter que se introduce a través de una arteria periférica y se dirige al corazón, la administración directa en las arterias coronarias permite una entrega más precisa de las células al área afectada (1-2).

El procedimiento por vía transendocárdica generalmente se realiza en un entorno quirúrgico especializado, se accede al corazón a través de una incisión en el tórax o mediante un catéter especializado (1-2).

Se introduce un catéter en el corazón, guiado por técnicas de imagen

Las células madre se inyectan directamente en el tejido cardíaco dañado (1-2).

Resultados a corto, mediano y largo plazo

Estos resultados han sido corroborados por TOPCAREAMI y STIM, que señalan una mejoría persistente y una reducción significativa del tamaño de infarto. Por otro lado, el estudio reportó mejorías significativas a 6 meses de la infusión intracoronaria en pacientes infartados, así mismo demostró efectos persistentes sobre este parámetro a 18 y 60 meses de seguimiento (1).

AVANCES

-Las perspectivas futuras para el uso de factores cardiorregenerativos están relacionadas con el desarrollo de nuevas tecnologías de formulación combinadas con materiales inteligentes, biocompatibles y no invasivos. Estos avances deberían funcionar como estructuras multifuncionales que combinen funciones terapéuticas y diagnósticas en una única estructura micro o nanoestructurada (2).

-Se han desarrollado y refinado técnicas como la inyección intracoronaria, transepicárdica, e intravenosa para maximizar la eficacia de la terapia celular

-Se ha observado una disminución en el tamaño de las cicatrices cardíacas, lo cual es crucial para mejorar la función del corazón después de un infarto

-Se ha avanzado en la comprensión de cómo las células madre extracardiacas y estromales interactúan con el tejido cardíaco y promueven la reparación

-Algunos estudios han mostrado mejoras significativas en la función cardíaca y en la calidad de vida de los pacientes tratados con células madre (2).

Bibliografía 

1.- Riverón LJ, Morales L et al. Terapia celular en el infarto del miocardio. Rev. 16 de Abril. 2017 [citado 17 agosto 2024]; 56(266):187-193. Disponible en: https://www.medigraphic.com/pdfs/abril/abr-2017/abr17266j.pdf

2.- Souza J, Santos N et al. Regeneración cardíaca mediante factores de crecimiento: avances y desafíos. Arq. Bras. Cardiol. 2016 [citado 17 agosto 2024]. Disponible en:https://www.scielo.br/j/abc/a/Fg7ghQ4vzSgh9PXrdVKRG7j/?lang=en

Animal transgénico para uso en medicina

RATONES TRANSGÉNICOS: 

Los ratones transgénicos son una herramienta crucial en la investigación médica moderna, diseñadas mediante la modificación genética para estudiar y comprender enfermedades humanas y evaluar nuevos tratamientos

VENTAJAS

• Contribuyen al desarrollo y prueba de nuevas vacunas al proporcionar un modelo para evaluar la respuesta inmunitaria y la eficacia de las vacunas antes de realizar ensayos clínicos.
• Ofrecería oportunidades para la creación de nuevos medicamentos y productos médicos
• Fomentaría el uso de xenotrasplantes.
• Facilitaría la selección de razas de animales más productivas y resistentes.
• Mediante la inserción de determinados genes en ratones y animales de otras especies se pueden estudiar, a ciencia cierta, las enfermedades, saber cómo funcionan y probar diferentes tratamientos hasta encontrar el mejor.

DESVENTAJAS

• La modificación genética en ratas puede tener efectos imprevistos y complejos como: malformaciones, alteraciones neuronales y cardíacas en embriones, así como la muerte de células germinales y testiculares, que podrían interferir con la interpretación de los datos experimentales.
• Un riesgo significativo de la transgénesis es que muchas de las transferencias y multiplicaciones genéticas se realizan mediante vectores, los cuales pueden tener características no deseadas. Estos vectores a menudo provienen de virus patógenos, plásmidos bacterianos u otros elementos genéticos móviles como los transposones, que pueden integrarse en el genoma del organismo receptor y causar daño.
• Estos vectores tienen el potencial de cruzar barreras entre especies, inducir resistencia a antibióticos y superar los mecanismos de defensa del organismo receptor que normalmente identificarían y eliminarían el ADN extranjero.
• La creación y el cuidado de ratas transgénicas pueden ser bastante costosos. Los gastos incluyen la generación de las ratas con modificaciones genéticas, así como su cuidado y manejo diario. También se deben sumar los costos de las instalaciones necesarias y del personal que trabaja en los experimentos.
• La generación y utilización de ratas transgénicas puede suscitar dilemas éticos, particularmente en lo que respecta al cuidado y bienestar de los animales.

BIBLIOGRAFÍA

1.- Lara C. Transgénesis: una aproximación a sus riesgos y beneficios. Acta méd centro [Internet]. 2021 [citado 25 de julio del 2024] vol.15 no.1. Disponible en:http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2709-79272021000100141

ADN recombinante artificial (quimérico) o clonación de genes

Producción de una lectina recombinante de frijol tépari (phaseolus acutifolius) con efecto citotóxico sobre células de cáncer de colon

Tema: Producción sintética de lectina recombinante de frijol Tépari con actividad citotóxica sobre células de cáncer

Objetivos: Generar un sistema de producción independiente del frijol, que constituya una plataforma de obtención continua y permita implementar estrategias que contribuyan a facilitar el proceso. Para ello, la secuencia codificante de una de las lectinas presuntamente responsables del efecto biológico de la FCL fue acoplada a una cola de hexahistidinas y fusionada en fase con el “factor-α” de S. cereviscea. Este material genético se introdujo en la levadura Pichia pastoris que, a su vez fue transferida a cultivo líquido bajo condiciones controladas para favorecer la producción de la proteína. El rendimiento final obtenido fue de 316 mg de lectina recombinante (LR)/L de medio de cultivo. La elaboración de mutantes de la LR, se logró demostrar que la sustitución conservativa de los residuos Arg132 y Arg103 deriva en una importante disminución de su citotoxicidad sobre células de cáncer de colon (1).

G: Gen o secuencia a clonar: Gen de la lectina (rTBL-1)

ER: Enzimas de restricción: enzimas PstI y XbaI

EL: Enzima ligasa: Ligasa T4 de Fermentas

V: Vector: pGAPZαB

CR: Célula receptora: TOP10 de Escherichia coli-levadura Pichia pastoris

MTG: Mecanismo de transferencia o inserción de gen: se procedió con la transformación de P. pastoris mediante el uso del kit Pichia EasyCompTM Transformation Kit de la casa comercial de Thermo Fisher Scientific

MIC: Métodos de identificación de clones: Cultivo-secuenciación- Escrutinio de clonas mediante PCR de colonia utilizando un juego de primers- electroforesis en gel de agarosa (1). 

Ácidos Nucleicos recombinantes en la naturaleza

La invención se centra en ácidos nucleicos que contienen segmentos del virus de la gastroenteritis transmisible (TGEV) y secuencias que codifican al menos un fragmento inmunológico del virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV). Estos ácidos nucleicos han sido modificados para incluir un residuo que forma un puente disulfuro y para eliminar sitios de glicosilación que podrían interferir con la producción de anticuerpos.

Además de los ácidos nucleicos, la invención abarca vectores, células huésped y partículas virales que contienen estas secuencias. El objetivo principal es desarrollar composiciones farmacéuticas, especialmente vacunas, que puedan inducir una respuesta inmune más efectiva contra el PRRSV. Esto se logra combinando elementos genéticos de TGEV y PRRSV modificados para mejorar la capacidad de generar anticuerpos que puedan neutralizar el virus (2).

Bibliografía

1.- Martínez D. Producción de una lectina recombinante de frijol tépari (phaseolus acutifolius) con efecto citotóxico sobre células de cáncer de colon [Internet]. 2017 [citado el 21 de julio del 2024]. Disponible en: https://repositorio.cinvestav.mx/bitstream/handle/cinvestav/1634/SSIT0009788.pdf?sequence=1

2.- Gurpegui S, Sánchez E et al. Ácidos nucleicos que codifican para vacunas contra el virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) [Internet]. 2011 [citado el 21 de julio del 2024]. Disponible en:https://digital.csic.es/handle/10261/40667

Prueba molecular de secuenciación en el cáncer de mama

 

Secuenciación de sanger en el cáncer de mama

La gran mayoría de las alteraciones genéticas responsables del cáncer de mama y ovario corresponden a variantes puntuales en los genes BRCA1/2, consisten en cambios de una sola base o deleciones/inserciones de pocas bases que producen truncamiento de proteínas, interrupción del procesamiento del ARN mensajero o sustituciones de aminoácidos que tienen un impacto significativo en la función de la proteína. Estas variantes son detectadas mediante la secuenciación Sanger, que es el método Gold standard para el análisis genético de variantes puntuales, método por el cual se determina la secuencia de nucleótidos del ADN, mediante electroforesis capilar de productos fluorescentes

Bibliografía:

1.- Benítez J et al. Nuevo abordaje en el diagnóstico del cáncer de mama y ovario hereditario mediante secuenciación masiva [Internet]. 2023 [citado 21 de junio 2024]. Disponible en: https://roderic.uv.es/rest/api/core/bitstreams/de7c65ef-cb0e-4c57-bc74-55ba08a9aa13/content

Una técnica de PCR

 Técnica de PCR en la influenza (virus de la gripe)

Los virus de la influenza son virus de ARN, existen tres tipos (tipo A, B y C). El genoma viral segmentado está encerrado en una envoltura superficial que contiene lípidos y que tiene hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N), dos antígenos de superficie principales. La confirmación de la influenza (virus de la gripe) se puede realizar mediante cultivo del virus, RT-PCR o anticuerpos neutralizantes específicos en la sangre a partir de hisopos nasofaríngeos/faríngeos o aspirados traqueales en pacientes intubados, preferiblemente dentro de los 4 a 5 días posteriores a la enfermedad. La prueba de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) sigue siendo la principal base de diagnóstico (1).

Imagen. Researchgate.net [Internet] [citado 15 junio 2024]. Disponible en: https://www.researchgate.net/figure/Figura-1-Flujograma-que-resume-los-pasos-de-la-tecnica-RT-PCR-1-Recoleccion-de-las_fig1_357357615

Tema: Diagnostico del virus de la gripe (Influenza)

Objetivo: Presentar la técnica de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) múltiple para la detección del virus de la gripe (influenza), lo que la convierte en un método indispensable en diversos campos de la biología molecular y la medicina

Tipo de muestra biológica: hisopado nasofaríngeo/orofaríngeo o aspirados

Tipo de ácido nucleico: ARN viral, su extracción se realizó usando el kit comercial QIAamp® Viral RNA mini kit (Qiagen) y se almacenó a -80 ºC hasta el procedimiento de RT-PCR múltiple

Gen o secuencia a amplificar: gen de la matriz del virus influenza A (1027 pb), gen de la nucleoproteína del virus influenza B (1565 pb) y el gen GAPDH de las células huésped (1200 a 1500 pb), gen de la hemaglutinina de los subtipos A (H1N1) pandémico (pdm09) con 13,600 pb y A (H3N2) con 13,588 pb

Tipo de PCR: RT-PCR múltiple en tiempo real.

Número de copias: El límite de detección viral fue del rango de 7 a 9 copias/µL por virus

Visualización: Para visualizar los resultados de una RT-PCR múltiple se utilizan: electroforesis en gel, microarrays y fluoróforos específicos (2).

Bibliografía

1.- Kumar V. Influencia en niños. Indian J Pediatr [Internet]. 2016 [citado 15 Jun 2024]; 84(2):139-143. Disponible en: https://link.springer.com/article/10.1007/s12098-016-2232-x

2.- Marcos P, Huaringa M et al. Detección de virus influenza A, B y subtipos A (H1N1) pdm09, A (H3N2) por múltiple RT-PCR en muestras clínicas. Rev. Perú. Med. [Internet]. 2017 [citado 17 de junio 2024]; vol.34 no.2. Disponible en: http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342017000200005